PCR 擴增 DNA 是實(shí)驗室中常用的基礎技術(shù)，隨著(zhù)技術(shù)的發(fā)展，其應用范圍不斷擴展，包括臨床檢測。定量 PCR (qPCR) 是一種可靠的已建立的方法，允許對靶 DNA 進(jìn)行相對定量，例如基于 PCR 的冠狀病毒測試使用 qPCR。相比之下，數字 PCR (dPCR) 或液滴數字 PCR (ddPCR) 使用類(lèi)似的化學(xué)方法檢測 DNA 序列，但在許多微小體積或液滴中進(jìn)行檢測，利用數學(xué)的力量提高信噪比。
雖然 qPCR 和 dPCR 有很多相似之處和不同之處，但在與 PCR 專(zhuān)家交談時(shí)，有幾個(gè)重要的品質(zhì)更加突出。隨著(zhù)時(shí)間的推移，PCR 技術(shù)在不斷發(fā)展，因此這些品質(zhì)也可能會(huì )隨之改變。本文旨在討論當今 qPCR 和 dPCR 技術(shù)之間的一些重要區別，以及它們在不同領(lǐng)域的最佳應用。
01
靈敏度，以及絕對與相對定量
多年來(lái)，定量 PCR 一直是許多應用的黃金標準。然而，dPCR 能夠提供更靈敏的測量和目標 DNA 的絕對定量（相對于 qPCR 的相對定量）。"使用 qPCR，科學(xué)家只能通過(guò)將結果與標準曲線(xiàn)進(jìn)行比較來(lái)確定樣本中的核酸濃度，"生物制藥部門(mén)經(jīng)理 Marwan Alsarraj 解釋道。"另一方面，ddPCR 直接量化核酸，因此對小核酸濃度更敏感，使工具更準確。"
這使得 dPCR 非常適合于目標存在于復雜樣本中的應用，例如分析來(lái)自液體活檢的循環(huán)腫瘤 DNA。"隨著(zhù)目標分子變得越來(lái)越少，檢測和精確量化這些分子變得越來(lái)越具有挑戰性，" dPCR 高級總監兼總經(jīng)理 Paul Hung 說(shuō)道。"由于 dPCR 自然稀釋了許多反應中的分子，因此當給定目標存在于高濃度的非目標分子中時(shí)，可以提高靈敏度。"盡管如此，qPCR 仍然是許多應用的首選方法，因為其速度更快，更易于使用，并且可以在更大的樣本集中進(jìn)行相對定量。
02
在實(shí)驗室和診所中越來(lái)越多地使用 dPCR
dPCR 的靈敏度提高使得研究實(shí)驗室和診所都受益。“隨著(zhù)細胞和基因治療研究和開(kāi)發(fā)的不斷發(fā)展，開(kāi)發(fā)人員越來(lái)越多地轉向 dPCR 來(lái)精確測量不同的目標，包括工程病毒載體、基因編輯事件、質(zhì)粒和完整衣殼，”P(pán)aul Hung 表示。
在臨床領(lǐng)域，如腫瘤學(xué)和器官移植等方面，dPCR 檢測稀有 DNA 的能力以及量化稀有 DNA 中微小但有顯著(zhù)的倍數變化，也受到了青睞。例如，dPCR 被用于檢測癌癥患者的循環(huán)腫瘤 DNA，并評估細胞和基因治療的正確劑量。“隨著(zhù)精準醫學(xué)變得越來(lái)越主流，我們預計 ddPCR 將在臨床中變得更加普遍，因為 ddPCR 可以檢測腫瘤負荷響應癌癥治療的微小變化，”Marwan Alsarraj 表示。“例如，使用 ddPCR 進(jìn)行連續監測可以使腫瘤學(xué)家識別治療后有復發(fā)風(fēng)險的患者。”然而，在某些情況下，qPCR仍然是臨床應用的首選方法，因為它更快速，更易于使用，并且可以在更大的樣本集中進(jìn)行相對定量。
03
動(dòng)態(tài)范圍和靈活性
盡管 dPCR 在靈敏度方面表現出色，但在許多其他應用中，qPCR 仍然是最佳選擇。"我們建議我們的客戶(hù)在基因表達中使用 qPCR，因為它的動(dòng)態(tài)范圍很廣；其量化不同表達水平、區分剪接變體和多重分析的能力；及其高通量應用和自動(dòng)化的能力，" Marwan Alsarraj 表示。實(shí)際上，在實(shí)驗室和監管環(huán)境中，qPCR 更為廣泛應用，并且被廣泛用于基因、健康狀況或傳染病的篩查。
在分析大量樣本時(shí)，qPCR 可能比 dPCR 更為經(jīng)濟實(shí)惠。"qPCR 本質(zhì)上是一種靈活且具有成本效益的技術(shù)，可滿(mǎn)足許多研究需求，使研究人員能夠選擇適合其特定需求的耗材，包括多種反應化學(xué)、分析選項和易于互換的塑料，" Paul Hung 表示。"在生物制藥行業(yè)，qPCR 被用于單克隆抗體、疫苗、細胞和基因治療以及生物仿制藥的制造過(guò)程中，作為質(zhì)量控制和基因分析的工具。"
隨著(zhù)不斷的創(chuàng )新和廣泛的使用，qPCR 的應用只會(huì )擴大。"科學(xué)家們不斷發(fā)現使用 qPCR 的新方法，因為它已經(jīng)從基因表達擴展到制造和診斷的過(guò)程測試，"Alsarraj 表示。"我們希望隨著(zhù)技術(shù)核心應用的成熟，創(chuàng )新將繼續下去。"
04
多重應用的進(jìn)展
盡管 qPCR 曾經(jīng)在多重檢測方面具有優(yōu)勢，但數字 PCR（dPCR）正在迅速成為發(fā)展更高的多重檢測功能的平臺。例如，Stilla Technologies 的 naica ®系統等平臺可以運行 30 重或更多的 dPCR 反應。“一些客戶(hù)可以在 naica ®系統上運行與在 qPCR 儀器上相同的分析，但他們只運行一次樣品并獲得絕對定量，而不是依賴(lài)標準曲線(xiàn)并不得不重復運行他們的樣品，”Stilla Technologies 全球營(yíng)銷(xiāo)和商業(yè)運營(yíng)副總裁 Matthew Grow 表示。“在 naica ®系統為研究人員提供了查看擴增和檢測效率的能力，一直到單個(gè)液滴的水平，每個(gè) PCR 反應在他們珍貴的樣本中并行發(fā)生。”
隨著(zhù) dPCR 能夠檢測稀有基因表達或癌癥相關(guān)的拷貝數變異事件，更多的多路復用可能會(huì )揭示更多未來(lái)使用的途徑。“多重 dPCR 是對當前下一代測序技術(shù)的出色補充，可以讓醫院實(shí)驗室有機會(huì )進(jìn)行更多的內部患者檢測，而不必與外包或集中式實(shí)驗室合作，”Matthew Grow 指出。
盡管如此，qPCR 和 dPCR 可能會(huì )繼續以互補關(guān)系存在。“我們已經(jīng)看到 qPCR 對于監測和管理 COVID-19 大流行的重要性，它將仍然是臨床測試實(shí)驗室、分析開(kāi)發(fā)人員和生物技術(shù)行業(yè)的重要工具，”P(pán)aul Hung 表示。“隨著(zhù) dPCR 技術(shù)通過(guò)簡(jiǎn)化的工作流程和更快的回答時(shí)間變得更容易獲得，它將在需要穩健、可靠和精確量化的用例中得到采用。因此，兩種技術(shù)將繼續在不同的應用場(chǎng)景中發(fā)揮各自的優(yōu)勢。”
2023-9-8 |
